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酶切鑒定

簡要描述:限制性內切酶是一種工具酶,這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈DNA 分子上的特異核苷酸順序的能力,能在這個特異性核苷酸序列內,切斷DNA 的雙鏈,形成一定長度和順序DNA 片段。對環狀質粒DNA有多少切口,就能產生多少酶切片段,因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區帶數,就可以推斷酶切口的數目,用已知分子量的線狀DNA 為對照,從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。

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  • 更新時間:2024-05-13
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酶切鑒定

    限制性內切酶是一種工具酶,這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈DNA 分子上的特異核苷酸順序的能力,能在這個特異性核苷酸序列內,切斷DNA 的雙鏈,形成一定長度和順序DNA 片段。對環狀質粒DNA有多少切口,就能產生多少酶切片段,因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區帶數,就可以推斷酶切口的數目,用已知分子量的線狀DNA 為對照,從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。

酶切鑒定操作步驟
1.培養細菌
將帶有質粒的大腸桿菌DH5α接種在LB 瓊脂培養基上,37℃培養24~48h。
2.從細菌中快速提取制備質粒DNA。

3.質粒DNA 的酶解
將自提質粒加入20μL 的 TE 緩沖液,使 DNA *溶解。取清潔、干燥、滅菌的離心管編號用微量加樣器按各種試劑分別加入每個離心管內。
4.DNA酶切加樣要求:

   1).選擇合適的酶切位點,并找到*緩沖液的酶切Buffer,可保證幾乎100%的酶活性.

   2).每小時10-15U/ul的酶可以酶切1ug的質粒DNA,按照比例計算酶的使用量,酶量的加倍,可適當減少酶切時間。

   3).質粒DNA的量通常在反應體系中擴大10倍量,確保酶切*。1小時內,50μl反應體積中,降解1μg的底物DNA所需的酶為一個活力單位。因此酶:DNA的反應比例可以由此確定。較小的反應體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下,要注意酶的體積不要超過總體積的10%(一般酶都貯存于50%的甘油中)。 

   4).有的酶要求100μg/ml的BSA以實現*活性。在這種情況下,我們也相應提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響。 

   5).補無菌雙蒸水至相應體系,依實際情況做相應調整,加樣后,小心混勻,置于37℃水浴中,酶解2~3h,反應終止后,各酶切樣品于冰箱中貯存備用。
5.DNA 瓊脂糖凝膠電泳
  (1)瓊脂糖凝膠的制備:稱取0.6g 瓊脂糖,置于三角瓶中,加入50 mL TBE 緩沖液,經微波爐加熱全部融化后,取出搖勻,此為1.2%的瓊脂糖凝膠。
  (2)膠板的制備:將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液,小心倒入凝膠液,使膠液緩慢展開,直到在整個玻璃板表面形成均勻的膠層,室溫下靜置30 min,待凝固*后,輕輕拔出樣品槽模板,在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。
  (3)加樣:用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內。每次加完一個樣品,要用蒸餾水反復洗凈微量加樣器,以防止相互污染。
6. 電泳
加完樣品后的凝膠板,立即通電。樣品進膠前,應使電流控制在20mA,樣品進膠后電壓控制在60~80V,電流為40~50 mA。當指示前沿移動至距離膠板1~2cm 處,停止電泳。
7、結果與觀察
在波長為254nm 的紫外燈下,觀察DNA 存在處顯示出的熒光條帶。
 

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